Analisa Kadar Protein

Protein

•          Terdiri dari asam amino yang diikat oleh rantai peptida

•          Mempunyai berat molekul bervariasi à 5000-jutaan dalton

•          Diklasifikasikan berdasarkan :

•          Komposisi

•          Struktur

•          Fungsi biologis

•          Kelarutan protein

•          Denaturasi à pemutusan ikatan peptida à mempengaruhi sifat kelarutan protein

•          Nitrogen adalah unsur utama protein

•          Namun kandungannya bervariasi dalam makanan (13,4-19,1%) à karena komposisi asam amino spesifik dari protein

Analisa Protein penting untuk :

•          Label Gizi

•          Mengetahui sifat fungsional protein à pengolahan makanan

•          Menentukan aktivitas biologisnya à enzim proteolitik untuk mengempukkan daging, pektinase untuk mematangkan buah

ANALISA PROTEIN untuk mengetahui : 

•          Kandungan protein total

•          Kandungan protein dalam campuran

•          Kandungan protein selama isolasi dan purifikasi

•          Nitrogen non protein

•          Komposisi asam amino

•          Nilai Gizi protein

Analisa Protein :

•          Kjeldahl

•          Dumas

•          Infrared Spectroscopy

•          Biuret

•          Lowry

•          Bradford dye-binding

•          Metode Turbidimetri atau kekeruhan

•          Metode Pengecatan

•          Penentuan protein dengan titrasi formol

v  Metoda Kjeldal :

•          Metode peneraan empiris

•          Kelemahan metode Kjeldal :

–        Senyawa bukan protein ada yang mengandung N, walaupun jumlah nya lebih sedikit dari protein

•          Jumlah protein dengan cara ini à jumlah protein kasar (crude protein)

Tahap analisa metode Kjeldal :

1.       Destruksi

2.       Destilasi

3.       Titrasi

Tahap Destruksi (digestion) :

•          Sampel dipanaskan dengan asam sulfat pekat sehingga terjadi destruksi menjadi unsur-unsurnya. Nitrogen à (NH₄)₂SO₄

•          Biasanya ditambah katalisator untuk mempercepat reaksi, berupa campuran Na₂SO₄ dan HgO (20:1) atau K₂SO₄ dan CuSO₄

Tahap Destilasi

•          Ammonin sulfat (NH₄)₂SO₄ dipecah menjadi ammonia (NH₃) dengan penambahan alkalis dan dipanaskan.

•          Ammonia yang lepas ditangkap oleh larutan asam standar (asam klorida/ asam borat 4%)

Titrasi

•          Anion borat dititrasi dengan HCL terstandarisasi

•          Terjadi konversi membentuk Nitrogen

KEUNTUNGAN :

•          Dapat diaplikasikan pada semua jenis makanan

•          Tidak mahal (jika tidak meggunakan autosistem)

•          Akurat untuk protein kasar

•          Dapat dimodifikasi untuk mengukur jumlah kecil protein

KELEMAHAN :

•          Mengukur total N organik, termasuk N yang bukan protein

•          Memakan waktu (2 jam)

•          Ketelitian rendah dibanding biuret methode

•          Reagen bersifat korosif

v  DUMAS

ü  Telah dimodifikasi dan automatis untuk memperbaiki akurasi

ü  Alternatif dari kjeldahl dan dapat digunakan untuk semua jenis makanan

PRINSIP :

•          Protein dibakar dengan suhu tinggi (700-1000 C)sehingga dibebaskan nitrogen

•          Protein dihitung dengan cara mengalikan  dengan faktor konversi

PROSEDUR :

•          Sampel (100-500 mg) dimasukkan dalam tabung kapsul kemudian dibakar dalam reaktor automatis

•          N bebas diukur dengan GC

Keuntungan  :

•          Bahan kimia tidak berbahaya

•          Dapat diselesaikan dalam 3 menit

•          Alat terbaru dapat menganalisa 150 sampel

Kelemahan :

•          Alat mahal

•          Mengukur total N organik, termasuk N yang bukan protein

v  Metode Lowry

ü  Konsentrasi protein diukur pada panjang gelombang 600 nm

ü  Protein standar : Albumin serum darah sapi, BSA

ü  Perlu membuat kurva standard

KEUNTUNGAN :

•          Sangat sensitif

–        50-100x lebih sensitif dari metoda biuret

–        10-20 x lebih sensitif dari UV absorption methode

–        Sama dengan Nesslerization (prosedur alternatif)

•          Kurang dipengaruhi oleh turbiditas sampel

•          Lebih spesifik

•          Sederhana dapat dilakukan 1-1.5 jam

KELEMAHAN :

•          Warna bervariasi pada protein yang berbeda

•          Warna tidak terbatas pada konsentrasi proteinàsenyawa fenol dapat membentuk warna biru sehingga dapat mengganggu hasil penetapan.

•          Reaksi dapat dipengaruhi oleh à sukrosa, lipid, buffer phosphat, monosakarida,heksoamin

v  Metode Biuret

Prinsip : ikatan peptida protein membentuk komplek berwarna ungu dengan garam Cu pada kondisi basa.

•          Warna yang terbentuk sering tidak identik à perlu distandarisasi dengan protein yang sudah diketahui

KEUNTUNGAN :

•          Murah 

•          Cepat  (30 menit)

•          Penyimpangan warna jarang ditemukan dibandingkan metode lain (lowry, Uvabsorption, turbidimetri)

•          Sangat sedikit substansi lain yang terdeteksi

•          N dari non peptida dan non protein tidak terdeteksi

KELEMAHAN :

•          Kurang sensitif dibanding Lowry

•          Penyerapan warna dapat dipengaruhi oleh pigmen jika ada

•          Konsentrasi tinggi dari garam ammonium menimbulkan reaksi

•          Variasi warna pada protein yang berbeda

•          Bukan metode absolut perlu standarisasi warna

•          Penyimpangan warna dapat terjadi di larutan akhir jika tingginya lemak atau KH

v  Infrared Spectroscopy

·         Mengukur penyerapan radiasi oleh molekul dalam makanan atau substansi lain

·         Perbedaan komponen à perbedaan frekuensi penyerapan

·         Karakteristik dari ikatan peptida dapat digunakan untuk memperkirakan kandungan protein dalam bahan.

·         Digunakan untuk menentukan kandungan protein susu

·         Juga dapat digunakan untuk padi, sereal, daging dan produk susu.

·         Alat mahal dan harus dikalibrasi dengan tepat, namun cepat (30 detik sampai 2 menit)

Perbandingan metode :

•          Kjeldahl, Dumas dan Infrared Spec à memerlukan sedikit preparasi.  ukuran partikel £20 mesh sudah cukup. Sedangkan metode lain memerlukan preparasi lebih banyak.

•          Kjeldahl dan Dumas à mengukur jumlah total N, sedangkan metode lain mengukur sifat-sifat protein

•          Biuret à mengukur kombinasi ikatan peptida

•          Lowry à mengukur kombinasi ikatan peptida dan asam amino triptofan dan tirosin

•          Infrared Spec à metode tidak langsung untuk memperkirakan kandungan protein berdasarkan enerdi yang terserap, ketika sample ditujukan pada panjang gelombang dari radiasi infrared.

•          Kjeldahl, Dumas dan Biuret lebih rendah sensitivitasnya dibanding Lowry, Bradford

•          Infrared Spec paling cepat.

•          Dumas lebih cepat dibanding Kjeldahl

Yang perlu diperhatikan dalam pemilihan dan analisa :

•          Sifat fisikokimia bahan

•          Metode proses pengolahan makanan à pemanasan dapat menurunkan daya ektrak protein untuk analisa dan menyebabkan underestimate

•          Semua methode kecuali Dumas dan Kjeldahl memerlukan standard (protein refrence), sehingga pemilihan standard yang sesuai menjadi penting.

•          N non protein dapat diatasi dengan ektraksi sampel di bawah kondisi alkalin kemudian diendapkan dengan tricloroacetic acid atau sulfosalycilyc acid. Pemanasan dapat digunakan untuk membantu pengendapan dengan alkohol,asam atau pelarut organik lain.

•          Dalam penentuan nilai gizi protein (protein digestibility atau PER) metode kjeldahl dengan faktor konversi 6,25 dapat digunakan untuk menentukan kandungan protein kasar.

Kualitas Nilai Gizi Protein :

•          Kualitas Nilai Gizi Protein ditentukan oleh komposisi AA dan digestibility (daya cerna) protein.

•          Antinutrisi dapat mempengaruhi Kualitas Nilai Gizi Protein ex. Tripsin inhibitor

•          Beberapa metode uji mutu protein menggunakan  informasi tentang AA essensial dalam makanan

•          AA essensial à tidak dapat disintesis tubuh sehingga harus ada dalam diet.

Penentuan Kualitas Protein :

•          Protein digestibility-Koreksi Skor Asam Amino

–        Menentukan komposisi AA dalam makanan

–        Menghitung skor asam amino (mg AA dalam 1 g protein/mg AA dalam 1 g reference protein).

–        In vivo à tikus jantan dengan diet standard + 10 % protein atau tanpa protein. Kemudian dihitung True Digestibility

–        True digestibility à N yang terserap (N makanan-N feses)/N yang masuk.

–        PDCAAS à Skor AA x %true digestibility

–        Untuk nutritional labeling (50 g = Daily value for protein à (g protein/serving x PDCAAS value)/50 g protein.

•          PER (protein efficiency ratio)

–        menguji kualitas protein secara in vivo dengan mengukur pertumbuhan (berat badan) tikus per gram protein yang dikonsumsi

–        Menentukan kandungan N sampel kemudian menghitung kandungan proteinnya

–        Membuat diet standard +10 % protein dan diet standard +10% casein sebagai kontrol

–        Memberi makan dan air minum selama 28 hari secara ad libitum (bebas).

–        Catat berat badan tikus awal dan setiap 7 hari sekali sampai hari ke 28

–        Catat makanan yang terkonsumsi selama 28 hari.

–        Hitung PER menggunakan rata-rata berat badan dan total rata-rata konsumsi.

–        Hitung faktor koreksi  à PER protein uji/ PER casein kontrol