Protein
•
Terdiri
dari asam amino yang diikat oleh rantai peptida
•
Mempunyai
berat molekul bervariasi à 5000-jutaan dalton
•
Diklasifikasikan
berdasarkan :
•
Komposisi
•
Struktur
•
Fungsi
biologis
•
Kelarutan
protein
•
Denaturasi
à pemutusan
ikatan peptida à mempengaruhi sifat kelarutan protein
•
Nitrogen
adalah unsur utama protein
•
Namun
kandungannya bervariasi dalam makanan (13,4-19,1%) à karena komposisi asam amino
spesifik dari protein
Analisa
Protein penting untuk :
•
Label
Gizi
•
Mengetahui
sifat fungsional protein à pengolahan makanan
•
Menentukan
aktivitas biologisnya à enzim proteolitik untuk mengempukkan daging,
pektinase untuk mematangkan buah
ANALISA
PROTEIN untuk mengetahui :
•
Kandungan
protein total
•
Kandungan
protein dalam campuran
•
Kandungan
protein selama isolasi dan purifikasi
•
Nitrogen
non protein
•
Komposisi
asam amino
•
Nilai
Gizi protein
Analisa
Protein :
•
Kjeldahl
•
Dumas
•
Infrared
Spectroscopy
•
Biuret
•
Lowry
•
Bradford
dye-binding
•
Metode Turbidimetri atau kekeruhan
•
Metode Pengecatan
•
Penentuan protein dengan titrasi formol
v Metoda Kjeldal :
•
Metode
peneraan empiris
•
Kelemahan
metode Kjeldal :
–
Senyawa
bukan protein ada yang mengandung N, walaupun jumlah nya lebih sedikit dari
protein
•
Jumlah
protein dengan cara ini à jumlah protein kasar (crude protein)
Tahap analisa
metode Kjeldal :
1. Destruksi
2. Destilasi
3. Titrasi
Tahap Destruksi (digestion) :
•
Sampel dipanaskan dengan asam sulfat pekat
sehingga terjadi destruksi menjadi unsur-unsurnya. Nitrogen à (NH4)2SO4
•
Biasanya ditambah katalisator untuk mempercepat
reaksi, berupa campuran Na2SO4 dan HgO (20:1) atau K2SO4
dan CuSO4
Tahap Destilasi
•
Ammonin sulfat (NH4)2SO4
dipecah menjadi ammonia (NH3) dengan penambahan alkalis dan
dipanaskan.
•
Ammonia yang lepas ditangkap oleh larutan asam
standar (asam klorida/ asam borat 4%)
Titrasi
•
Anion
borat dititrasi dengan HCL terstandarisasi
•
Terjadi
konversi membentuk Nitrogen
KEUNTUNGAN :
•
Dapat
diaplikasikan pada semua jenis makanan
•
Tidak
mahal (jika tidak meggunakan autosistem)
•
Akurat
untuk protein kasar
•
Dapat
dimodifikasi untuk mengukur jumlah kecil protein
KELEMAHAN :
•
Mengukur
total N organik, termasuk N yang bukan protein
•
Memakan
waktu (2 jam)
•
Ketelitian
rendah dibanding biuret methode
•
Reagen
bersifat korosif
v DUMAS
ü
Telah
dimodifikasi dan automatis untuk memperbaiki akurasi
ü
Alternatif
dari kjeldahl dan dapat digunakan untuk semua jenis makanan
PRINSIP :
•
Protein
dibakar dengan suhu tinggi (700-1000 C)sehingga dibebaskan nitrogen
•
Protein
dihitung dengan cara mengalikan dengan
faktor konversi
PROSEDUR :
•
Sampel
(100-500 mg) dimasukkan dalam tabung kapsul kemudian dibakar dalam reaktor
automatis
•
N
bebas diukur dengan GC
Keuntungan :
•
Bahan
kimia tidak berbahaya
•
Dapat
diselesaikan dalam 3 menit
•
Alat
terbaru dapat menganalisa 150 sampel
Kelemahan
:
•
Alat
mahal
•
Mengukur
total N organik, termasuk N yang bukan protein
v Metode Lowry
ü
Konsentrasi
protein diukur pada panjang gelombang 600 nm
ü
Protein
standar : Albumin serum darah sapi, BSA
ü
Perlu
membuat kurva standard
KEUNTUNGAN :
•
Sangat
sensitif
–
50-100x
lebih sensitif dari metoda biuret
–
10-20
x lebih sensitif dari UV absorption methode
–
Sama
dengan Nesslerization (prosedur alternatif)
•
Kurang
dipengaruhi oleh turbiditas sampel
•
Lebih
spesifik
•
Sederhana
dapat dilakukan 1-1.5 jam
KELEMAHAN :
•
Warna
bervariasi pada protein yang berbeda
•
Warna
tidak terbatas pada konsentrasi proteinàsenyawa fenol dapat membentuk warna
biru sehingga dapat mengganggu hasil penetapan.
•
Reaksi
dapat dipengaruhi oleh à sukrosa, lipid, buffer phosphat,
monosakarida,heksoamin
v Metode Biuret
Prinsip : ikatan peptida protein membentuk
komplek berwarna ungu dengan garam Cu pada kondisi basa.
•
Warna
yang terbentuk sering tidak identik à perlu distandarisasi dengan protein
yang sudah diketahui
KEUNTUNGAN :
•
Murah
•
Cepat (30 menit)
•
Penyimpangan
warna jarang ditemukan dibandingkan metode lain (lowry, Uvabsorption,
turbidimetri)
•
Sangat
sedikit substansi lain yang terdeteksi
•
N
dari non peptida dan non protein tidak terdeteksi
KELEMAHAN :
•
Kurang
sensitif dibanding Lowry
•
Penyerapan
warna dapat dipengaruhi oleh pigmen jika ada
•
Konsentrasi
tinggi dari garam ammonium menimbulkan reaksi
•
Variasi
warna pada protein yang berbeda
•
Bukan
metode absolut perlu standarisasi warna
•
Penyimpangan
warna dapat terjadi di larutan akhir jika tingginya lemak atau KH
v Infrared Spectroscopy
·
Mengukur
penyerapan radiasi oleh molekul dalam makanan atau substansi lain
·
Perbedaan
komponen à
perbedaan frekuensi penyerapan
·
Karakteristik
dari ikatan peptida dapat digunakan untuk memperkirakan kandungan protein dalam
bahan.
·
Digunakan
untuk menentukan kandungan protein susu
·
Juga
dapat digunakan untuk padi, sereal, daging dan produk susu.
·
Alat
mahal dan harus dikalibrasi dengan tepat, namun cepat (30 detik sampai 2 menit)
Perbandingan metode :
•
Kjeldahl,
Dumas dan Infrared Spec à memerlukan sedikit preparasi. ukuran partikel £20 mesh sudah cukup. Sedangkan
metode lain memerlukan preparasi lebih banyak.
•
Kjeldahl
dan Dumas à
mengukur jumlah total N, sedangkan metode lain mengukur sifat-sifat protein
•
Biuret
à
mengukur kombinasi ikatan peptida
•
Lowry
à
mengukur kombinasi ikatan peptida dan asam amino triptofan dan tirosin
•
Infrared
Spec à
metode tidak langsung untuk memperkirakan kandungan protein berdasarkan enerdi
yang terserap, ketika sample ditujukan pada panjang gelombang dari radiasi
infrared.
•
Kjeldahl,
Dumas dan Biuret lebih rendah sensitivitasnya dibanding Lowry, Bradford
•
Infrared
Spec paling cepat.
•
Dumas
lebih cepat dibanding Kjeldahl
Yang perlu
diperhatikan dalam pemilihan dan analisa :
•
Sifat
fisikokimia bahan
•
Metode
proses pengolahan makanan à pemanasan dapat menurunkan daya ektrak protein
untuk analisa dan menyebabkan underestimate
•
Semua
methode kecuali Dumas dan Kjeldahl memerlukan standard (protein refrence),
sehingga pemilihan standard yang sesuai menjadi penting.
•
N
non protein dapat diatasi dengan ektraksi sampel di bawah kondisi alkalin
kemudian diendapkan dengan tricloroacetic acid atau sulfosalycilyc acid.
Pemanasan dapat digunakan untuk membantu pengendapan dengan alkohol,asam atau
pelarut organik lain.
•
Dalam
penentuan nilai gizi protein (protein digestibility atau PER) metode kjeldahl
dengan faktor konversi 6,25 dapat digunakan untuk menentukan kandungan protein
kasar.
Kualitas
Nilai Gizi Protein :
•
Kualitas
Nilai Gizi Protein ditentukan oleh komposisi AA dan digestibility (daya cerna)
protein.
•
Antinutrisi
dapat mempengaruhi Kualitas Nilai Gizi Protein ex. Tripsin inhibitor
•
Beberapa
metode uji mutu protein menggunakan
informasi tentang AA essensial dalam makanan
•
AA
essensial à
tidak dapat disintesis tubuh sehingga harus ada dalam diet.
Penentuan Kualitas
Protein :
•
Protein
digestibility-Koreksi Skor Asam Amino
–
Menentukan
komposisi AA dalam makanan
–
Menghitung
skor asam amino (mg AA dalam 1 g protein/mg AA dalam 1 g reference protein).
–
In
vivo à
tikus jantan dengan diet standard + 10 % protein atau tanpa protein. Kemudian
dihitung True Digestibility
–
True
digestibility à N
yang terserap (N makanan-N feses)/N yang masuk.
–
PDCAAS
à Skor
AA x %true digestibility
–
Untuk
nutritional labeling (50 g = Daily value for protein à (g protein/serving x PDCAAS value)/50
g protein.
•
PER
(protein efficiency ratio)
–
menguji
kualitas protein secara in vivo dengan mengukur pertumbuhan (berat badan) tikus
per gram protein yang dikonsumsi
–
Menentukan
kandungan N sampel kemudian menghitung kandungan proteinnya
–
Membuat
diet standard +10 % protein dan diet standard +10% casein sebagai kontrol
–
Memberi
makan dan air minum selama 28 hari secara ad libitum (bebas).
–
Catat
berat badan tikus awal dan setiap 7 hari sekali sampai hari ke 28
–
Catat
makanan yang terkonsumsi selama 28 hari.
–
Hitung
PER menggunakan rata-rata berat badan dan total rata-rata konsumsi.
–
Hitung
faktor koreksi à PER protein uji/ PER casein kontrol
0 komentar: