Isolasi DNA dan PCR

Isolasi DNA

1.      DNA, Deoxyribo Nucleic Acid merupakan materi genetik yang dimiliki oleh setiap organisme hidup.  Bergantung pada tipe selnya, DNA dapat disimpan dan dikemas dengan cara yang berbeda. Pada sel manusia  dimanakah DNA dapat ditemukan?

Jawab : Dapat ditemukan didalam setiap sel hidup ditubuh memiliki nukleus dan didalam setiap nukleus terdapat 2 meter DNA

2.      Apakah terdapat perbedaan antara DNA pada organisme prokaryotes dan eukaryotes?

Jawab :            Sel prokariota merupakan sel  yang belum memiliki nukleus atau tidak memiliki membran inti yang memisahkan materi genetic di inti sel dengan bagian sel lainnya. Materi genetic (DNA) pada sel prokariotik tampak terkonsentrasi pada suatu tempat yang disebut nucleoid. Sel prokariotik memiliki DNA sirkuler (plasmid), sejumlah ribosom yang berfungsi untuk sintesis protein, membran plasma yang membatasi sel, serta dinding sel yang terdapat disebelah luar membrane plasma dan dilapisi kapsul seperti gel. Sebagian sel prokariotik (bakteri) ada yang memiliki organel perlekatan berupa pili dan organel pergerakan berupa flagella. Sel bakteri (prokariotik) pada umumnya berdiameter 0,1-1,0 um Uraikan mengenai struktur DNA, komponen penyusunnya beserta ikatannya.

            Eukariotik merupakan sel yang memiliki nukleus yang sebenarnya atau materi genetic (DNA) yang dibungkus oleh membrane inti. Pada sitoplasma atau daerah antara nukleus dan membrane sel, terdapat medium semi cair yang disebut sitosol serta organel-organel sel yang sebagian besar tidak terdapat pada sel prokariotik. Sel eukariotik umumnya berdiameter 10-100 um

 

 

3.      Jelaskan struktur  rantai sense dan anti sense DNA.

Jawab : DNA SENSE adalah untaian DNA dengan arah 5′ → 3′ yang memiliki urutan / sekuens basa nitrogen sama dengan mRNA (kecuali T diganti U). Untaian ini juga dikatakan sebagai untaian positif (+). Dikarenakan untaian ini memiliki urutan yang sama dengan mRNA, maka untaianini disebut sebagai pengkode (coding). Untaian ini TIDAK ditranskripsi atau dicetak menjadi mRNA sehingga disebut anti-template.

DNA ANTISENSE adalah untaian DNA dengan arah 3’→ 5’ atau disebut untaian negatif (-). Untaian ini berperan untuk melakukan transkripsi membentuk mRNA sehingga untaian ini disebut Pencetak/Cetakan (Template). Arah 3’→5’ didasarkan pada untaian DNA ini ketika proses transkripsi oleh enzim RNA Polimerase. Urutan/Sekuens basa nitrogen pada untaian ini tidak sama dengan mRNA sehingga dikatakan sebagai non coding.

4.      Sebutkan beberapa kegunaan dari pemeriksaan DNA

Jawab :

·         Untuk pemeriksaan genetik

·         Mengidentifikasi tubuh

·         Menganalisis bukti forensik

5.      Apa yang dimaksud denaturasi dan renturasi DNA ? Jelaskan

Jawab :

Dua buah pita polinukleutida yang berbentuk double helix dalam molekul DNA dihubungkan oleh atom H yang sangat lunak. Jika suatu larutan yang mengandung DNA dipanaskan atau dibubuhi alkali yang kuat, maka hubungan nitrogen menjadi labil dan putus. Dua pita spiral dari molekul DNA terbuka. Proses ini dinamakan denaturasi DNA. Jika larutan tersebut kemudian didinginkan kembali atau dinetralisir secara perlahan-lahan, maka terbentuklah pasangan – pasangan basa kembali. Peristiwa ini dinamakan renaturasi.

Proses denaturasi dan renaturasi molekul DNA tergantung pada banyak faktor, antara lain :

·         Suhu. Suhu yang tinggi menyebabkan untai ganda DNA akan terurai menjadi untai tunggal, tetapi jika suhu diturunkan secara perlahan, maka akan terjadi renaturasi menjadi untai heliks ganda DNA seperti semula

·         Derajat keasaman (pH) yang ekstrem dapat menyebabkan DNA terdenaturasi

·         Konsentrasi isoelektrolit sepeprti Na⁺ dan K pada larutan ekstraksi yang digunakan

·         Perbandingan kandungan antara basa nukleutida GC terdapat AT. Tingginya kandungan GC akan memperlambat proses denaturasi molekul DNA. Sebaliknya, kandungan AT yang tinggi akan menyebabkan pita DNA mudah patah/putus.

 

6.      Bagaimana cara mengkuantifikasi DNA?

Jawab :

Analisis kuantifikasi DNA dapat dilakukan dengan bantuan alat yaitu spektrofotometer. Kuantikasi DNA merupakan suatu proses untuk memastikan bahwa DNA yang didapatkan dari ekstraksi adalah benar berasal dari manusia dan bukan berasal dari misalnya bakteri.

Metode yang digunakan untuk kuantifikasi DNA biasanya berupa absrobansi pada panjang gelombang 260 nm atau menggunakan fluorescence setelah pewarnaan menggunakan ethidium bromide. Namun, kekurangan dan metode ini adalah tidak begitu sensitif dan pengukuran absorbansi tidak spesifikuntuk DNA sehingga protein kontaminan atau fenol sisa ekstraksi dapat memberi perhitungan yang salah. Sekarang, telah dikembangkan beberapa metode baru seperti prosedur slot blot dan microtiter plate assay berbasis fluoresensi yang dapat disebut “real-time atau kuantitatif PCR.

 

 

 

 

 

7.      Berdasarkan pengamatan anda, Uraikan alat dan bahan yang dibutuhkan untuk mengisolasi DNA.

Jawab :

Alat yang dibutuhkan timbangan digital, mortar dan pestle, beaker glass, spatula, pipet, tabung reaksi, rak tabung reaksi, kertas label, mikropipet, oven cortex, centrifuge, autoclave, dan tube

Bahan yang digunakan polivinil pirolidon, akuades, chisam, buffer ekstraksi, nitrogen  cair, dan mercaptoethanol

8.      Uraikan komposisi  dari bahan-bahan yang digunakan beserta fungsinya.

Jawab :

Bahan	Fungsi
Polivinil pirolidon	Mencegah terjadinya browning dan kontaminasi fenol
Akuades	Sebagai pelarut
Chisam	Menghilangkan etanol dan flavanoid
Buffer ekstraksi	Melindungi DNA ketika terjadi reaksi kimia
Nitrogen cair	Untuk merusak dinding sel
Mercaptoethanol	Mencegah terjadinya browning dan kontaminasi polisakarida

 

9.      Apakah fungsi sentrifugasi dan hal apa yang penting untuk dilakukan sebelum memulai sentrifugasi.

Jawab :

Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung. Teknik sentrifugasi dilakukan oleh mesin yaitu mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi. Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan dibagian atas dan pelet di bagian bawah.

Dalam kerja sentrifugasi, sebelumnya sampel yang dikehandaki  ditimbang (sesuai kebutuhan dan ukuran tabung) dimasukan dalam tempat tabung pada sentrifugasi, agar putaran berimbang maka harus diseimbangkan antara sisi kanan dan kiri tempat tabung, penyeimbang bisa saja menggunakan tabung sampel yang diisi dan sudah disamakan ukuran dan beratnya, sehingga putaran kerja motor penggerak berimbang oleh beban.

 

10.  Pada tahapan presipitasi protein, dilakukan proses sentrifugasi dimana anda akan memperoleh sampel yang terpisah menjadi dua bagian :

a. Pada bagian manakah DNA akan berada

b. dan jelaskan jawaban anda.

Jawab : DNA dan cairan berkumpul dibagian atas (a) dan dibagian bawah (b) merupakan gumpalan dari protein dan sel

11.  Pada tahapan selanjutnya adalah pengendapan DNA, reagen apa yang ditambahkan untuk mendapatkan DNA ?

Jawab : isopropyl alcohol sehingga didapatkan gumpalan DNA yang tidak larut dalam reagen tersebut